柱式質(zhì)粒DNAout
產(chǎn)品及特點(diǎn) 本試劑盒是用于質(zhì)粒DNA小量制備與純化的試劑盒。菌體先經(jīng)堿裂解法處理,再通過(guò)離心吸附柱,專一結(jié)合DNA,zui后洗去雜質(zhì),快速提取質(zhì)粒DNA,全套操作可以在30分鐘之內(nèi)完成。使用本試劑盒可從1-5 mL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液純化得到高達(dá)20 ug的高純度質(zhì)粒DNA(OD260/OD280 = 1.8-2.0),可以直接用于酶切、轉(zhuǎn)化、測(cè)序及PCR等。
1. 快速、步驟少,整個(gè)操作在半個(gè)小時(shí)之內(nèi)完成。
2. 不需要預(yù)平衡離心吸附柱。
3. 洗柱液即開即用,不需要額外加乙醇。
4. 純度高,采用本試劑盒提取的質(zhì)粒OD比值在1.8-2.0之間。
5. 產(chǎn)量高,每毫升過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌可以提取到2-5 ug/mL。
6. 用途廣,適用于低拷貝和高拷貝質(zhì)粒。
7. 價(jià)格低,比多數(shù)國(guó)內(nèi)同類產(chǎn)品的價(jià)格更便宜。
規(guī)格及成分 成 份 50次大紙盒包裝 100次大紙盒包裝
溶液A(CAT#:6020) 13 mL 26 mL
溶液B(CAT#:60205B) 13 mL 26 mL
溶液C(CAT#:60205C) 18 mL 36 mL
RNase A溶液,10mg/mL
(CAT#:3160) 0.15 mL 0.3 mL
通用洗柱液(CAT#:60408) 50 mL 100 mL
DNA洗脫液2.0
(CAT#:111205) 10 mL 10 mL
離心吸附柱(CAT#:90303) 50只 100只
離心吸附柱套管(CAT#:90511) 50只 100只
使用手冊(cè) 1份 1份
運(yùn)輸及保存 常溫運(yùn)輸和保存,RNase A需要-20℃保存,有效期一年。
自備試劑 無(wú)
使用方法 1. 先將全部RNase A溶液全部加入到溶液A中,搖勻后再取用,未用完的溶液A在4℃保存。
2. 從篩選平板上挑取單菌落至含抗生素的培養(yǎng)基中,37℃震蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)(搖床轉(zhuǎn)速200-300)。注意:建議使用LB培養(yǎng)基,營(yíng)養(yǎng)更豐富的培養(yǎng)基會(huì)使菌體濃度過(guò)高,超過(guò)純化系統(tǒng)處理能力而降低DNA質(zhì)量。另外,延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間有利于提高質(zhì)粒DNA濃度,但是菌液培養(yǎng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間會(huì)因細(xì)胞死亡、裂解而造成質(zhì)粒DNA濃度降低。
3. 用1.5 mL離心管收集1-4 mL過(guò)夜培養(yǎng)飽和菌液,室溫12,000 rpm離心1分鐘,棄上清,再短暫離心,吸棄殘留液體。
4. 加入250 uL溶液A,用槍頭充分吹打使菌體重懸(此步在冰上操作效果更佳)。注意:細(xì)胞未充分懸浮會(huì)影響后續(xù)操作,可以使用漩渦振蕩器幫助混勻或使用Tip吸頭吹打沉淀至*混勻。
5. 加入250 uL溶液B(如果溶液B有沉淀,用前須37℃加熱溶解后冷卻到室溫方可使用),溫和反復(fù)顛倒混勻4-6次,看到溶液變粘即可,然后冰上放置不超過(guò)4-5分鐘。注意:此步處理不能超過(guò)5分鐘,否則DNA的堿損傷比較嚴(yán)重。同時(shí)千萬(wàn)不要?jiǎng)×艺袷?,否則基因組DNA斷裂產(chǎn)生的片段非常容易污染質(zhì)粒DNA。溶液B用后需要將蓋擰緊存放,否則空氣中的二氧化碳會(huì)進(jìn)入溶液,形成碳酸,中和溶液B中的NaOH,降低其效率)。
6. 加入350 uL冰上預(yù)冷的溶液C,反復(fù)顛倒混勻4-6次,可見白色沉淀物產(chǎn)生,然后冰上放置至少5分鐘。
7. zui高轉(zhuǎn)速(12,000 rpm以上)4℃離心5分鐘,小心將上清液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中。由于此時(shí)的溶液比重較大,有時(shí)候出現(xiàn)沉淀漂浮是正常現(xiàn)象,取上清時(shí)避開漂浮的沉淀即可。如果此步的離心在室溫進(jìn)行,更容易出現(xiàn)沉淀物漂浮的現(xiàn)象。
8. 靜置2分鐘以讓質(zhì)粒DNA與吸附柱充分結(jié)合,此步十分重要。
9. 室溫12,000 rpm離心1分鐘,棄收集管中的廢液。
10. 加入500 uL的通用洗柱液,室溫12,000 rpm離心1分鐘,棄收集管中廢液。注意:通用洗柱液中含乙醇,用后需要將蓋擰緊存放,否則乙醇會(huì)揮發(fā)。
11. 重復(fù)上步1次。
12. 室溫12,000 rpm離心1分鐘,甩干殘留液體。此步不能省略,否則殘留乙醇會(huì)影響DNA的后續(xù)使用(如DNA上樣時(shí)不能沉淀到加樣孔中)。
13. 將離心吸附柱置于一個(gè)新的1.5 mL塑料離心管(自備)中,加入30-100 uL 65-80℃預(yù)熱的DNA洗脫液2.0,室溫放置2分鐘。常溫的DNA洗脫液2.0也可以用于洗脫,但產(chǎn)量稍微有所降低。
14. 室溫12,000 rpm離心1分鐘,離心管底溶液即質(zhì)粒DNA。
15. 由于天澤基因的吸附柱結(jié)合DNA能力較強(qiáng),如果再加適量DNA洗脫液2.0到離心吸附柱中,往往還能洗脫下很多質(zhì)粒DNA(相當(dāng)于*次洗脫的20-30%),但注意不要使用上步得到的DNA洗脫液2.0來(lái)洗脫。