一、器材
剪刀(剪兔毛用)一把、彎頭眼科手術(shù)鑷子(游離血管用)一把、直頭眼科手術(shù)剪(剪血管用)一把,手術(shù)刀架,手術(shù)刀片,注射器(1ml、10ml,25ml)附針頭,兔子固定架,滅菌三角燒瓶(200ml)或平皿(直徑450px)、彎頭止血鉗四把,直頭止血鉗兩把,手術(shù)縫合線,塑料放血管,紗布等。
二、兔子的選擇
兔子的重量應(yīng)在四斤以上,兩耳光滑,明顯可見耳靜、動脈,健康。
三、免疫
用生理鹽水稀釋免疫原,然后與相應(yīng)的佐劑進(jìn)行1:1混合??乖妥魟?混合形成穩(wěn)定的乳劑,將該乳劑在兔子雙肩周圍的皮膚下進(jìn)行皮下注射和后大腿進(jìn)行肌肉注射。每個區(qū)域大約用1/4的免疫原。這樣免疫原可以持久存在從而提高免疫應(yīng)答。
注:
抗原注射以前需要收集一些正常血清,已備檢測抗體時作為陰性對照。待兔子在新環(huán)境中穩(wěn)定,大概需要四天左右時間,可以進(jìn)行耳動脈取血。取血量約5ml足矣。
免疫用的抗原必須純化,否則影響抗體的質(zhì)量??乖?jīng)FCA或FIA充分乳化后才能注射。將抗原液與佐劑等比例混合后,置于混合器上使之劇烈振蕩使抗原充分乳化,乳化過程比較費時、費力,但若乳化不充分,會影響免疫的效果,振蕩后,1000rpm離心一分鐘,如水相和油相不分層即可注射。免疫用FCA,以后都用FIA。
免疫方法可采用背部多點注射法。即于家兔脊柱兩旁選4-6點皮下注射,每點注0.1ml,間隔2周后再于上述部位選不同點注射(不要選擇臨近位點,否則潰瘍愈合不好)。每次免疫的抗原量約100μg。免疫次數(shù)在四五次即可,抗原用量大可以減少次數(shù)。
四、試劑
生理鹽水(或PBS)
弗氏*佐劑(Freund’s complete adjuvant, FCA)
弗氏不*佐劑(Freund’s incomplete adjuvant, FIA)
二甲苯,酒精棉,脫脂棉,2% NaN3
五、免疫原:蛋白或KLH偶聯(lián)的多肽。每次免疫100-200μg免疫原。
六、取血:
免疫一周后,可以耳動脈取血檢測抗體效價。因為起初幾次免疫產(chǎn)生的抗體的效價比較低,頭兩次取血,夠檢測用即可。在三次免疫后,可以獲得較價的抗體,每次取血量可以在40ml,不要取太多,否則會造成兔子貧血。
前幾次取血用19號針頭對兔子進(jìn)行耳動脈取血,室溫析出血清。
zui后一次取血可以采用頸動脈放血,具體操作如下:
1、家兔仰臥于兔架上固定頭部,用紗布固定四肢。頭部略放低以暴露頸部。剃毛并消毒皮膚。
2、沿頸部中線用手術(shù)刀切開皮膚約250px,分離皮下結(jié)締組織,直至暴露出氣管兩側(cè)的胸鎖乳突?。ㄐ⌒牟僮鳎缗龅叫⊙艹鲅?,可用止血鉗止血)。
3、用直頭止血鉗分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織,暴露出頸總動脈后用彎頭眼科鑷使之游離,剝離神經(jīng)和結(jié)締組織。
4、于動脈下套入兩根黑絲線,分別置于遠(yuǎn)心及近心端。結(jié)扎遠(yuǎn)心端的絲線。近心端的動脈用血管夾夾住。
5、用小拇指墊在血管下,用尖頭眼科手術(shù)剪在兩根絲線間的動脈璧上剪一小口(勿剪斷),插入塑料放血管。再將近心端的絲線結(jié)扎固定于放血管上,以防放血管滑脫。
6、松開止血鉗,使血液流入容器中。一般一只家兔可放血100-120ml。
七、血清的分離
如果用三角瓶或平皿盛血,將器皿傾斜放置于37oC烘箱2h,轉(zhuǎn)移到4oC沉淀,第二天早上用吸管吸取血清。如果用離心管收集,37oC烘箱放置2h,轉(zhuǎn)移到4oC沉淀,第二天早上離心,10000RCF,10分鐘。在血清中加入NaN3 至終濃度0.02%,分裝后-20oC保存。