鳴胚成纖維細(xì)胞具有相對容易獲得、增殖能力強、適應(yīng)性強、良好的耐受性、性狀比較穩(wěn)定等特點,使得其被廣泛地應(yīng)用于分子和細(xì)胞生物學(xué)研究的許多方面。
一,材料
1.孵育10d雞胚2只。
2.培養(yǎng)用液含10%CS的MEM、O.25%胰酶、PBS、D—Hanks液、CS等。
3.器皿與儀器鑷子、眼科剪、各種吸管、培養(yǎng)瓶、顯微鏡、培養(yǎng)皿、三角燒瓶、離心管、不銹鋼網(wǎng)、細(xì)胞計數(shù)器等。
二、方法
1.取雞胚取10d雞胚于蛋架上,用75%乙醇消毒蛋殼,用剪刀和鑷子去除氣室部蛋殼,用無菌彎頭小鑷輕輕取出雞胚,并放人無菌平皿中。
2.組織處理用彎頭小鑷夾起腹部皮膚,剪開腹腔和胸腔去除雞胚內(nèi)臟,留下的雞胚組織用Hanks液洗2次。然后將雞胚組織移人小三角燒瓶內(nèi),用剪刀反復(fù)剪成lmm3大小的組織塊,用Hanks液洗2次。
3.消化將洗液上清液吸棄,根據(jù)沉下雞胚組織塊的多少,加入10倍量的O.25%胰酶,置37℃水浴中消化30min,消化時每隔5min搖動一次,使組織塊散開,視其組織碎塊變的疏松,從水浴鍋中取出。用毛細(xì)管輕輕吸出消化液,用Hanks液洗3次,加10ml生長液(不加血清),用吸管反復(fù)吹打,使細(xì)胞分散,然后將分散好的細(xì)胞懸液通過不銹鋼網(wǎng)·補足10%CS或加10%FBS,制成細(xì)胞懸液。
4.細(xì)胞計數(shù)與分裝取上述獲得的單細(xì)胞懸液少量,進(jìn)行1:5稀釋后計數(shù),然后調(diào)細(xì)胞濃度為O.5×106/ml,分裝于培養(yǎng)瓶內(nèi)。待細(xì)胞培養(yǎng)有一定經(jīng)驗后,可省略細(xì)胞計數(shù)步驟,而憑經(jīng)驗估計細(xì)胞濃度,如一只10日齡雞胚制成lOml細(xì)胞懸液時細(xì)胞數(shù)約為4×106/ml,也可視其懸液的透明度來估計。
三、結(jié)果觀察
將上述培養(yǎng)物置37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng),每天對培養(yǎng)接種的細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)檢查,觀察的主要內(nèi)容有:細(xì)胞生長狀態(tài)、污染與否、pH等。如培養(yǎng)液為橘紅色,一般說明細(xì)胞生長良好。一般于24h后可見到許多細(xì)胞貼壁,由圓形懸浮狀態(tài)的細(xì)胞延展成短梭形。2~3d后長成單層細(xì)胞,換維持液后即可用于實驗,或經(jīng)傳代后再長成單層細(xì)胞時使用。
四、注意事項
消化時溫度不能高于37℃,消化時間不宜過強。如果胰酶消化過強,則細(xì)胞易被損傷不宜生存。