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抗腫瘤藥物敏感性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法
更新時(shí)間:2015-12-31   點(diǎn)擊次數(shù):1781次

    抗腫瘤藥物敏感性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法繁多,大體上分為體內(nèi)和體外兩類(lèi)方法。各種方法各有其優(yōu)點(diǎn)和局限性,使用某一種方法難以確定藥物抗癌作用,應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選擇適當(dāng)?shù)姆椒?。本章分別介紹體外抗腫瘤藥物敏感試驗(yàn)及體內(nèi)抗腫瘤藥物敏感試驗(yàn)。其中,體外抗腫瘤藥物敏感試驗(yàn)包括四噻唑藍(lán)法藥物敏感試驗(yàn)、致死細(xì)胞染色法藥敏試驗(yàn)、3 H—TdR摻人法藥物敏感試驗(yàn)、染料排斥試驗(yàn)法、生長(zhǎng)曲線測(cè)定法、集落形成試驗(yàn)法和三磷酸腺苷生物發(fā)光法。體內(nèi)抗腫瘤藥物敏感試驗(yàn)包括裸鼠移植瘤試驗(yàn)和小鼠腎包膜下腫瘤移植試驗(yàn)。

    腫瘤患者常因腫瘤病因和類(lèi)型不同以及個(gè)體差異的原因,對(duì)化療藥物的敏感性有很大差異。為了減少臨床選擇化療藥物的盲目性,實(shí)行個(gè)體化治療,化療前預(yù)測(cè)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性至為重要。腫瘤細(xì)胞化療藥物敏感性的主要指標(biāo)是細(xì)胞數(shù)量的增減。但是這一指標(biāo)不能顯示細(xì)胞的死亡和存活方面的信息,而用活細(xì)胞數(shù)量的增減來(lái)表達(dá)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性更為恰當(dāng)。目前檢測(cè)腫瘤細(xì)胞存活狀況的主要方法為臺(tái)盼藍(lán)拒染法、四噻唑藍(lán)(methvlthiazolete trazoliunl,MTT)法和放射性同位素?fù)饺朔?。臺(tái)盼藍(lán)拒染法由于其指標(biāo)判斷人為因素較多,較少應(yīng)用。而MTT法能客觀、準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的存活狀態(tài),故較常應(yīng)用。

(一)四噻唑藍(lán)法藥物敏感試驗(yàn)

1.試驗(yàn)原理在正常情況下,細(xì)胞線粒體進(jìn)行三羧酸循環(huán)過(guò)程中,琥珀酸脫氫酶能催化琥珀酸脫氫,并氧化成延胡索酸;而MTT可接受脫下來(lái)的H+ ,使可溶性的黃色MTT變成難溶性、紫藍(lán)色的沉淀,并沉積在細(xì)胞中,而死的細(xì)胞則無(wú)此功能。再用DMSO溶解縈色的沉淀,在酶標(biāo)儀下測(cè)定其吸光度A值,即可計(jì)算出存活細(xì)胞數(shù)。該方法具有快捷、方便、靈敏、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn),并與臨床治療有較好的一致性。MTT快速比色法已被推薦為抗癌藥物的篩選方法。

2.材料

(1)待檢藥物:待測(cè)定的化療藥物。

(2)細(xì)胞:臨床腫瘤細(xì)胞的主要來(lái)源是由外科手術(shù)獲取。將切下的腫瘤組織立即放人裝有培養(yǎng)液的無(wú)菌凍存管中,4℃保存,12h內(nèi)使用。也可以是體外培養(yǎng)的細(xì)胞株。

(3)試劑:MTT(用pH7.2~7.4的PBS現(xiàn)用現(xiàn)配成5mg/ml MTT,或配好后避光4℃儲(chǔ)存,備用l周)、含10%CS的RPMI 1640培養(yǎng)液(內(nèi)含100 U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)、Halaks液、DMSO、O.1%膠原蛋白酶、O.25%胰蛋白酶一O.02%EDTA、HBSS。

(4)器材:無(wú)菌的96孔培養(yǎng)板、手術(shù)剪、100目和200目不銹鋼網(wǎng)、培養(yǎng)皿、離心管、加樣槍及槍頭、酶標(biāo)儀等。

3.實(shí)驗(yàn)方法

(1)無(wú)菌條件下剔除壞死及非腫瘤組織,用Hanks液沖洗1次。

(2)用下述方法之一將腫瘤組織分散為單細(xì)胞:

1)機(jī)械分散法:充分剪碎腫瘤組織,經(jīng)100目和200目不銹鋼網(wǎng)擠壓過(guò)濾,收集細(xì)胞。

2)酶消化分散法:充分剪碎腫瘤組織,首先經(jīng)o.1%膠原蛋白酶37℃下消化20min,再用O.25%胰蛋白酶一O.02%EDTA混合液(1:1)37℃下消化,收集細(xì)胞。

(3)將分散的細(xì)胞懸液加入含100%和75%淋巴細(xì)胞分離液的梯度離心管中,2000r/min離心20min,吸取zui上層(75%分離液的界面上)的腫瘤細(xì)胞。

(4)用Hanks液離心洗滌2次,棄上清液,加入適量培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞。

(5)立即將腫瘤細(xì)胞懸液以每孔103~104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板(200μl/孔),同時(shí)加入事先確定濃度梯度的各組抗癌藥10μl/孔(對(duì)照組加入培養(yǎng)液10μl/孔)。在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)48~72h(培養(yǎng)時(shí)間取決于實(shí)驗(yàn)的目的和要求)。

(6)每孔加入MTT(5mg/m1)20μl,37℃作用4h。

(7)小心吸棄各孔內(nèi)的上清液,對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞需1000r/min離心5min,然后再吸棄上清液。每孔加入DMSO 150μl,振蕩,使紫藍(lán)色沉淀充分溶解,用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450~600nm處測(cè)定吸光度A值。

(8)各藥物濃度組設(shè)3個(gè)平行孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值計(jì)算藥物作用后腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

4.結(jié)果分析若實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率大于50%,即表明藥物有效。

 

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