細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。現(xiàn)在我們就來講講如何正確的凍存細胞:
一、材料
(一)儀器 1. 凈化工作臺 2. 離心機 3. 恒溫水浴箱 4. 冰箱(4℃、-20℃、-70℃) 5. 倒置相差顯微鏡 6. 培養(yǎng)箱 7. 液氮冰箱
(二)玻璃器皿 1. 吸管(彎頭、直頭) 2. 培養(yǎng)瓶 3. 玻璃瓶(250ml、100ml) 4. 廢液缸
(三)塑料器皿 1. 吸頭 2. 槍頭 3. 膠塞 4. 移液管(10ml) 5. 15ml離心管 6. 凍存管(1~2ml)
(四)其他物品 1. 微量加樣槍 2. 紅血球計數(shù)板 3. 記號筆 4. 醫(yī)用橡皮膏 5. 移液槍
(五)試劑 1. D-Hanks液 2. 小牛血清 3. 培養(yǎng)液 4. 雙抗(青霉素、鏈霉素) 5. 胰蛋白酶(0.08%) 6. 1NHCl 7. 7.4%NaHCO3 8. DMSO(分析純)或無色新鮮甘油
二、操作步驟
(一)細胞凍存
1. 配制含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液;
2. 取對數(shù)生長期的細胞,用胰蛋白酶把單層生長的細胞消化下來,懸浮生長的細胞則直接將細胞移至15ml離心管中、;
3. 離心1000rpm,5min;
4. 去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液,加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液,用吸管輕輕吹打使細胞均勻,計數(shù),調節(jié)凍存液中細胞的zui終密度為5×106/ml~1×107/ml;
5. 將細胞分裝入凍存管中,每管1~1.5 ml;
6. 在凍存管上標明細胞的名稱,凍存時間及操作者;
7. 凍存:標準的凍存程序為降溫速率-1~-2℃/ min;當溫度達-25℃以下時,可增至-5℃~-10℃/ min;到-100℃時,則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h ,然后放入-70℃冰箱中**,取出凍存管,移入液氮容器內(nèi)。
(二) 細胞復蘇
1. 從液氮容器中取出凍存管,直接浸入37℃溫水中,并不時搖動令其盡快融化。
2. 從37℃水浴中取出凍存管,打開蓋子,用吸管吸出細胞懸液,加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液,混勻;
3. 離心, 1000rpm,5min;
4. 棄去上清液,加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細胞,計數(shù),調整細胞密度,接種培養(yǎng)瓶,37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng);
5. 次日更換一次培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。
三、注意事項
1.從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養(yǎng)細胞都可以用于凍存,但為對數(shù)生長期細胞。在凍存前一天換一次培養(yǎng)液;
2.將凍存管放入液氮容器或從中取出時,要做好防護工作,以免凍傷;
3.凍存和復蘇用新配制的培養(yǎng)液。