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實時熒光定量PCR技術
更新時間:2012-04-25   點擊次數(shù):1295次

實時熒光定量PCR技術

實時熒光定量PCR原理

  所謂實時熒光定量PCR技術,是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程,zui后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。 

1. Ct 值的定義

  在熒光定量PCR技術中,有一個很重要的概念 -- Ct值。C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含義是:每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(如圖1所示)。 

2. 熒光域值(threshold)的設定

  PCR反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號,熒光域值的缺省設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍,即:threshold = 10 ′ SDcycle 6-15 

3. Ct值與起始模板的關系

  研究表明,每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系〔1〕,起始拷貝數(shù)越多,Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線,其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù),縱坐標代Ct值(如圖2所示)。因此,只要獲得未知樣品的Ct值,即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 

4. 熒光化學

  熒光定量PCR所使用的熒光化學可分為兩種:熒光探針和熒光染料。現(xiàn)將其原理簡述如下: 

  1)TaqMan熒光探針:PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時,報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時,Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術既可進行基因定量分析,又可分析基因突變(SNP),有望成為基因診斷和個體化用藥分析的技術平臺。 

  2)SYBR熒光染料:在PCR反應體系中,加入過量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后,發(fā)射熒光信號,而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。 

內標在傳統(tǒng)定量中的意義

1. 幾種傳統(tǒng)定量PCR方法簡介:

  1)內參照法:在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物,內標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記,下游引物不標記。在模板擴增的同時,內標也被擴增。在PCR產(chǎn)物中,由于內標與靶模板的長度不同,二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或液相分離開來,分別測定其熒光強度,以內標為對照定量待檢測模板。 

  2)競爭法:選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中,待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增(其中一個引物為熒光標記)。擴增后用內切酶消化PCR產(chǎn)物,競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段,而待測模板不被酶切,可通過電泳或液相將兩種產(chǎn)物分開,分別測定熒光強度,根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。 

  3)PCR-ELISA法:利用地高辛或生物素等標記引物,擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針所結合,再加入抗地高辛或生物素酶標抗體-辣根過氧化物酶結合物,zui終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR-ELISA法只是定性實驗,若加入內標,作出標準曲線,也可實現(xiàn)定量檢測目的。 

實時熒光定量PCR技術

2.內標在傳統(tǒng)定量中的作用

  由于傳統(tǒng)定量方法都是終點檢測,即PCR到達平臺期后進行檢測,而PCR經(jīng)過對數(shù)期擴增到達平臺期時,檢測重現(xiàn)性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復實驗,所得結果有很大差異(見圖4),因此無法直接從終點產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內標后,可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準確性。但即使如此,傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。 

編輯本段內標對熒光定量PCR的影響

1.實時熒光定量PCR無需內標

  有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限,實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度,并記錄在電腦軟件之中,通過對每個樣品Ct值的計算,根據(jù)標準曲線獲得定量結果。因此,實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的: 

  1)Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時,剛剛進入真正的指數(shù)擴增期(對數(shù)期),此時微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現(xiàn)性*,即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增,得到的Ct值是恒定的。 

  2)Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關系,可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定,因此,實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。 

2.內標對實時熒光定量PCR的影響

  若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內標,則PCR反應變?yōu)殡p重PCR,雙重PCR反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭,尤其當兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時,這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的,所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內標。也正是這個原因,傳統(tǒng)定量方法雖然加入內標,但仍然只是一種半定量的方法。 

  美國Texas大學的科研人員進行了外標法定量和內標法定量的方法學比較,得出的結論是:內標法作為定量或半定量的手段是不可靠的,而外標準曲線的定量方法是一種準確的、值得信賴的科學方。 

實時熒光定量PCR儀是*的熒光定量PCR的金標準,可實現(xiàn)多色熒光同時檢測,但定量檢測仍然采用外標準曲線的方法,而不用內標進行定量。 

  綜上所述,利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量zui準確,重現(xiàn)性的定量方法,已得到*的*,廣泛用于基因表達研究、轉基因研究,藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。 

  熒光PCR是分子診斷的熱點技術,它將先進的定量PCR與實時PCR技術相結合,國產(chǎn)實時熒光定量PCR儀為肝炎艾滋病等重大疾病的定量核酸檢測及分子診斷、同時也為沙門氏菌阪崎氏腸桿菌等食品安全檢測提供了先進手段。即使在發(fā)達國家,熒光定量PCR儀和基因擴增儀都被廣泛用于臨床及生物學、醫(yī)學研究。由于其*的靈敏度、極寬的檢測范圍,以及定量、方便快速、無窗口期等優(yōu)點,美國FDA及我國已將定量PCR儀規(guī)定為確診禽流感等傳染病以及奶粉等食品安全檢測的*儀器。 

  實時熒光定量PCR儀(real-time qPCR)的發(fā)明實現(xiàn)了榮獲諾貝爾化學獎的PCR核酸檢測、分子診斷的技術飛躍。 

臨床疾病診斷:

  各型肝炎、艾滋病、禽流感、結核、性病等傳染病診斷和療效評價;地中海貧血、血友病、性別發(fā)育異常、智力低下綜合癥、胎兒畸形等優(yōu)生優(yōu)育檢測;腫瘤標志物及瘤基因檢測實現(xiàn)腫瘤病診斷;遺傳基因檢測實現(xiàn)遺傳病診斷。 

動物疾病檢測:

  禽流感、新城疫、口蹄疫、豬瘟、沙門菌、大腸埃希菌、胸膜肺炎放線桿菌、寄生蟲病等、炭疽芽孢桿菌。 

食品安全:

  食源微生物、食品過敏源、轉基因、乳品企業(yè)阪崎腸桿菌等檢測。 

科學研究:

  醫(yī)學、農(nóng)牧、生物相關分子生物學定量研究。 

應用行業(yè):

  各級各類醫(yī)療機構、大學及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。 

  由于qPCR是實時定量檢測致病病原體基因核酸,因此它比化學發(fā)光、時間分辨、蛋白芯片等免疫學方法更具獨到優(yōu)勢。 

技術原理:

  標記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后,完成高溫變性,低溫復性,適溫延伸的熱循環(huán),并遵守聚合酶鏈反應規(guī)律,與模板DNA互補配對的Taqman探針被切斷,熒光素游離于反應體系中,在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光,隨著循環(huán)次數(shù)的增加,被擴增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長,通過實時檢測與之對應的隨擴增而變化熒光信號強度,求得CT值,同時利用數(shù)個已知模板濃度的標準品作對照,即可得出待測標本目的基因的拷貝數(shù)。 

性能標準及參數(shù)

  標本載體 

  0.2ml薄壁PCR離心管 

  標本數(shù)量 

  標本數(shù)量36個,包括4個標準品 

  試 劑 

  SYBR Green I,F(xiàn)AM,Tex Red,F(xiàn)ITC等熒光染料,開放式PCR試劑 

  反應體系 

  10-100μL 

  建議質控 

  四個陽性標準品、陰性對照 

  指標 

  熒光激發(fā)波長 

  470nm 

  熒光發(fā)射波長 

  530nm,640nm,710nm 

  570nm,605nm 

  熒光檢測方式 

  光開關陣列組合光電倍增管PMT方式 

  控溫范圍 

  4.0℃-99.0℃ 

  熱蓋溫度 

  100℃~120℃ 

  升/降溫速度 

  ≥4.0℃/S(Max) 

  溫度均勻性 

  ≤±0.3℃ 

  溫度度 

  ≤±0.3℃ 

  溫度顯示精度 

  0.1℃ 

  檢測范圍 

  101~1010DNA/RNA copy/ml 

  CT值重復性誤差 

  CV≤2.1% 

  核酸精度相關系數(shù) 

  R≥0.997 

  軟件 

  溫階 

  1~9 

  循環(huán) 

  1~99 

  保溫時間 

  1~9999秒 

  文件 

  1~9個連接 

  升級方式 

  遠程硬件內控軟件升級 

  系統(tǒng)接口 

  RS-232C串行接口,雙向數(shù)據(jù) 

  主機操作系統(tǒng) 

  Windows2000/XP 

  產(chǎn)品外形尺寸 

  50cm × 40cm × 35cm 

  產(chǎn)品重量 

  25kg 

  使用環(huán)境 

  溫度5~40℃,相對濕度≤80% 

  使用電源 

  AC220 × (1±10%)V,50 × (1±2%)HZ 

  功耗 

  1100VA 

  多規(guī)格 

  提供96孔,多通道/多色、36孔等不同規(guī)格產(chǎn)品 

  技術應用實現(xiàn)快速均衡擴增檢測由光開關陣列、自聚焦透鏡和尾纖準直器及變增益微光O/E裝置組成的MEMS有機整體,在以16位單片機為核心的電控裝置管理下,能在毫秒級時間內完成多個標本快速均衡掃描檢測,避免了機械掃描方式或CCD掃描方式引起的時間滯后或漸暈誤差。實現(xiàn)標準樣本的PCR熱循環(huán)擴增及高通量實時熒光激發(fā)和定量檢測。 

產(chǎn)品突出特性

  « 走在PCR技術的前列 

  在PCR儀和市場化領域中歷史悠久; 

  將標準化的PCR檢測技術成功廣泛用于臨床; 

  « 快速實時PCR技術實現(xiàn)了DNA/mRNA檢測的快速性 

  實時檢測啟用熒光探針標記特定核酸的方法使準確性更高; 

  簡化了傳統(tǒng)PCR方法; 

  使用zui少的樣本量,在一小時左右出結果; 

  « 簡便閉管分析使您完成加樣后就無須再接觸樣本 

  減少樣本消耗殆盡風險; 

  縮短了出報告時間; 

  簡化了試驗步驟; 

  « 提高了用戶應用的靈活性 

  提供了用戶自定義PCR操作平臺; 

  建立您的用戶自定義應用; 

  分析用戶自定義試驗; 

  « 高性能 

  高靈敏度; 

  高特異性; 

  寬的動態(tài)范圍; 

  « 強大的軟件數(shù)據(jù)管理系統(tǒng) 

  完整的病例檔案; 

  集成化的網(wǎng)絡服務功能; 

  圖標顯示; 

  自動試劑及結果跟蹤; 

  客戶使用界面友好; 

  « 開放式、個性化儀器易于適應您的實驗室環(huán)境 

  « 免維護光源系統(tǒng) 

  高亮度窄帶LED光源,工作穩(wěn)定,使用壽命長,終身免維護 

  « 靈敏的光電系統(tǒng) 

  熒光激發(fā)/檢測單色器采用美國原產(chǎn)濾光片;檢測器采用日本原產(chǎn)金屬封裝式光電倍增管PMT,具有靈敏度高、快速、穩(wěn)定的特點;準直器、光開光陣列、光纖組件、電控裝置全部采用進口期間;精度高,一致性好。 

  « 先進的溫控系統(tǒng) 

  本儀器采用膜加熱及半導體熱泵制冷技術保證了升降溫的快速穩(wěn)定、儀器壽命長的特點,加有熱蓋保證了PCR無礦物油操作,避免了人為原因造成的污染。 

  « 先進的溫控系統(tǒng) 

  本儀器采用膜加熱及半導體泵制冷技術保證了升降溫的快速穩(wěn)定、儀器壽命長的特點,加有熱蓋保證了PCR無礦物油操作,避免了人為原因造成的污染。 

  « 友好的軟件系統(tǒng) 

  中文Windows傳統(tǒng)界面更符合國人操作習慣,多個標準參數(shù)填空式輸入降低了因參數(shù)設置所造成的事物;參數(shù)輸入提示保證了參數(shù)輸入的有效性。 

  « 多樣化的運行方式 

  每個程序段數(shù)多達9個;每個程序的步驟多達9個;每個程序的循環(huán)數(shù)多達99個,溫度、循環(huán)等多個參數(shù)的多種修正、調節(jié)方式,可*臨床及科研上試驗的要求。 

  « 良好的線性范圍、靈敏度、重復性 

  線性范圍廣、可檢測的樣品濃度線性范圍101~1010,靈敏度zui小分辨率為1拷貝,重復性CV≤2.1%。 

  « *的瞬時斷電保護功能 

  瞬時停電后本儀器可提醒用戶繼續(xù)試驗。因電網(wǎng)或其他或其他原因造成的短暫瞬時停電不再會給您的實驗帶來麻煩,為您減少試劑的損耗,解除您PCR實驗室沒有專線電源的顧慮。

 

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