5.1. 微生物菌種保藏
在發(fā)酵工業(yè)中，具有良好性狀的菌種的獲得十分不容易，如何利用優(yōu)良的微生物菌種保藏技術(shù)，使菌種經(jīng)長(zhǎng)期保藏后不但存活健在，而且保證高產(chǎn)突變株不改變表型和基因型，特別是不改變初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物的高產(chǎn)能力，即很少發(fā)生突變，這對(duì)于菌種極為重要。
微生物菌種保藏技術(shù)很多，但原理基本一致，即采用低溫、干燥、缺氧、缺乏營(yíng)養(yǎng)、添加保護(hù)劑或酸度中和劑等方法，挑選優(yōu)良純種，是它們的休眠體，使微生物生長(zhǎng)在代謝不活潑，生長(zhǎng)受抑制的環(huán)境中。具體常用的方法有：蒸餾水懸浮或斜面?zhèn)鞔２兀桓稍?載體保藏或冷凍干燥保藏；超低溫或在液氮中冷凍保藏等方法。
5.1.1. 蒸餾水懸浮法
這是一種zui簡(jiǎn)單的菌種保藏方法，只要將菌種懸浮于無(wú)菌蒸餾水中，將容器封好口，于10℃保藏即可達(dá)到目的。好氣性細(xì)菌和酵母等可用此法保存。
5.1.2. 斜面?zhèn)鞔２?
斜面?zhèn)鞔２胤椒ㄊ菍⒕N定期在新鮮瓊脂斜面培養(yǎng)基上、液體培養(yǎng)基中或穿刺培養(yǎng)，然后在低溫條件下保存。它可用于實(shí)驗(yàn)室中各類微生物的保藏，此法簡(jiǎn)單易行，且不要求任何特殊的設(shè)備。但此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、菌體自溶、基因突變、菌種退化、菌株污染等不良現(xiàn)象。因此要求在基本培養(yǎng)基上傳代，目的是能淘汰突變株，同時(shí)轉(zhuǎn)接菌量應(yīng)保持較低水平。斜面培養(yǎng)物應(yīng)在密閉容器中于5℃保藏，以防止培養(yǎng)基脫水并降低代謝活性。此方法一般不適宜作工業(yè)菌種的長(zhǎng)期保藏，一般保存時(shí)間為3~6個(gè)月。如放線菌于4~6℃保存，每3個(gè)月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6個(gè)月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6個(gè)月移接一次。
5.1.3. 礦物油中浸沒保藏
此方法簡(jiǎn)便有效，可用于絲狀真菌、酵母、細(xì)菌和放線菌的保藏。特別對(duì)難于冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養(yǎng)基上形成孢子的擔(dān)子菌等的保藏更為有效。是將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物或穿刺培養(yǎng)物浸入礦物油中于室溫下或冰箱中保藏，操作要點(diǎn)是首先讓待保藏菌種在適宜的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，然后注入經(jīng)160℃干熱滅菌1~2h或濕熱滅菌后120℃烘去水分的礦物油，礦物油的用量以高出培養(yǎng)物1cm為宜，并以橡皮塞代替棉塞封口，這樣可使菌種保藏時(shí)間延長(zhǎng)至1~2年。以液體石蠟作為保藏方法時(shí)，應(yīng)對(duì)需保藏的菌株預(yù)先作試驗(yàn)，因?yàn)槟承┚耆缃湍?、霉菌、?xì)菌等能利用石蠟為碳源，還有些菌株對(duì)液體石蠟保藏敏感。所有這些菌株都不能用液體石蠟保藏，為了預(yù)防不測(cè)，一般保藏菌株 2~3年也應(yīng)做一次存活試驗(yàn)。
5.1.4. 干燥-載體保藏
此法適用于產(chǎn)孢子或芽孢的微生物的保藏。是將菌種接種于適當(dāng)?shù)妮d體上，如河砂、土壤、硅膠、濾紙及麩皮等，以保藏菌種。以沙土保藏用得較多，制備方法為：將河砂經(jīng)24目過篩后用10%~20%鹽酸浸泡3~4 h，以除去其中所含的有機(jī)物，用水漂洗至中性，烘干，然后裝入高度約1cm的河沙于小試管中，121℃間歇滅菌3次。用無(wú)菌吸管將孢子懸液滴入砂粒小管中，經(jīng)真空干燥8 h，于常溫或低溫下保藏均可，保存期為1~10年。土壤法以土壤代替砂粒，不需酸洗，經(jīng)風(fēng)干、粉碎，然后同法過篩、滅菌即可。一般細(xì)菌芽孢常用砂管保藏，霉菌的孢子多用麩皮管保藏。
5.1.5. 冷凍保藏
冷凍保藏是指將菌種于-20℃以下的溫度保藏， 冷凍保藏為非常有效的方法。通過冷凍，使微生物代謝活動(dòng)停止。一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。為了保藏的結(jié)果更加令人滿意，通常在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護(hù)劑；同時(shí)還要認(rèn)真掌握好冷凍速度和解凍速度。冷凍保藏的缺點(diǎn)是培養(yǎng)物運(yùn)輸較困難。
普通冷凍保藏技術(shù)（-20℃）：將菌種培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待生長(zhǎng)適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴(yán)格封好，于冰箱的冷藏室中貯藏，或于溫度范圍在-5~20℃的普通冰箱中保存?；蛘邔⒁后w培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細(xì)胞分別接到試管或指管內(nèi)，嚴(yán)格密封后，同上置于冰箱中保存。用此方法可以維持若干微生物的活力 1~2年。應(yīng)注意的是經(jīng)過一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來(lái)保藏。這一方法雖簡(jiǎn)便易行，但不適宜多數(shù)微生物的長(zhǎng)期保藏。
超低溫冷凍保藏技術(shù)：要求長(zhǎng)期保藏的微生物菌種，一般都應(yīng)在-60℃以下的超低溫冷藏柜中進(jìn)行保藏。超低溫冷凍保藏的一般方法是：先離心收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期至后期的微生物細(xì)胞，再用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細(xì)胞，然后加入等體積的20％甘油或10％二甲亞砜冷凍保護(hù)劑，混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70℃超低溫冰箱中保藏。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1~2℃/ min。若干細(xì)菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。
液氮冷凍保藏技術(shù)：近年來(lái)，大量有特殊意義和特征的高等動(dòng)、植物細(xì)胞能夠在液氮中長(zhǎng)期保藏，并發(fā)現(xiàn)在液氮中保藏的菌種的存活率遠(yuǎn)比其他保藏方法高且回復(fù)突變的發(fā)生率極低。液氮保藏巳成為工業(yè)的方法。具體方法是：把細(xì)胞懸浮于一定的分散劑中或是把在瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)好的菌種直接進(jìn)行液體冷凍，然后移至液氮（-196℃）或其蒸汽相中（-l56℃）保藏。進(jìn)行液氮冷凍保藏時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制致冷速度。液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟是先制備冷凍保藏菌種的細(xì)胞懸液，分裝0.5~1ml入玻璃安瓿或液氮冷藏塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口。然后以1.2℃／min的致冷速度降溫，直到溫度達(dá)到相對(duì)溫度之上幾度的細(xì)胞凍結(jié)點(diǎn)（通常為-30℃）。待細(xì)胞凍結(jié)后，將致冷速度降為1℃／min，直到溫度達(dá)到-50℃，將安瓿迅速移入液氮罐中于液相（-196℃）或氣相 （-156℃）中保存。如果無(wú)控速冷凍機(jī)，則一般可用如下方法代替：將安瓿或液氮瓶置于-70℃冰箱中冷凍4h，然后迅速移入液氮罐中保存。在液氮冷凍保藏中，zui常用的冷凍保護(hù)劑是二甲亞砜和甘油，zui終使用濃度一般為甘油10％、二甲亞砜5％。所使用的甘油一般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜為過濾滅菌。
5.1.6. 真空凍干保藏
真空冷凍干燥的基本方法是先將菌種培養(yǎng)到zui大穩(wěn)定期后，一般培養(yǎng)放線菌和絲狀真菌約需7~10天，培養(yǎng)細(xì)菌約需24~28小時(shí)，培養(yǎng)酵母約需3天。然后混懸于含有保護(hù)劑的溶液中，保護(hù)劑常選用脫脂乳、蔗糖、動(dòng)物血清、谷氨酸鈉等，菌液濃度為109~1019個(gè)/ml，取0.1~0.2ml菌懸液置于安瓿管中冷凍，再于減壓條件下使凍結(jié)的細(xì)胞懸液中的水分升華至1%~5%，使培養(yǎng)物干燥。zui后將管口熔封，保存在常溫下或冰箱中。此法是微生物菌種長(zhǎng)期保藏的zui為有效的方法之一，大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久而不喪失活力。而且經(jīng)凍干后的菌株無(wú)需進(jìn)行冷凍保藏，便于運(yùn)輸。但操作過程復(fù)雜，并要求一定的設(shè)備條件。
5.1.7. 寄主保藏
適用于一些難于用常規(guī)方法保藏的動(dòng)植物病原菌和病毒。
5.1.8. 基因工程菌的保藏
隨著基因工程的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的基因工程菌需要得到合理的保藏，由于它們的載體質(zhì)粒等所攜帶的外源DNA片段的遺傳性狀不太穩(wěn)定、且其外源質(zhì)粒復(fù)制子很容易丟失。另外，對(duì)于宿主細(xì)胞質(zhì)?；蛲ǔ樯L(zhǎng)非必需，一般情況下當(dāng)細(xì)胞丟失這些質(zhì)粒時(shí)，生長(zhǎng)速度會(huì)加快。而由質(zhì)粒編碼的抗生素抗性在富集含此類質(zhì)粒的細(xì)胞群體時(shí)極為有用。當(dāng)培養(yǎng)基中加入抗生素時(shí)，抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞群體的極有用的生長(zhǎng)選擇壓。而且在運(yùn)用基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，抗生素的加入可幫助維持質(zhì)粒復(fù)制與染色體復(fù)制的協(xié)調(diào)。由此看來(lái)基因工程菌應(yīng)保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中。例如，質(zhì)粒pBR322。它除了能將外源DNA 輸入E．coli細(xì)胞外，還賦予E．coli細(xì)胞Ampr和Tetr。如果在培養(yǎng)基中加入Amp和Tet，則培養(yǎng)時(shí)可選擇出含pBR322質(zhì)粒的細(xì)胞。
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