一、溫度
一般哺乳類及禽類細胞體外培養(yǎng)的適宜溫度是37~38℃。溫度過高或過低都會影響到細胞的生長。細胞耐受低溫的能力比抗熱的能力強，在低溫下，細胞的代謝活力及核分裂降低。溫度不低于0℃時，雖影響細胞代謝，但并無傷害作用；把細胞置于25～35℃時，細胞仍能生存和生長，但速度減緩；放在40℃數(shù)小時后，再置回37℃培養(yǎng)細胞仍能繼續(xù)生長。但如果在40℃下暴露時間太長，對細胞生長不利，甚至變圓脫落于瓶壁。若溫度過低，在降到冰點以下時，細胞因胞外水和胞質結冰而受損死亡。但若向培養(yǎng)液中加入甘油或二甲亞砜等保護劑，封入安瓿中后，置于液氮中，可起保護作用，此時細胞可耐受-70℃以下溫度，能長期儲存，解凍后細胞復蘇，仍能繼續(xù)生長增殖，細胞生物性狀不受任何影響。此為保存細胞的主要手段。
高溫對細胞培養(yǎng)不利。細胞在39～40℃培養(yǎng)1小時，能受到一定損傷，但仍有可能恢復，但不能忍受溫度再升高2℃，持續(xù)數(shù)小時，即在41～42℃中培養(yǎng)1小時，細胞損傷嚴重，溫度至43℃以上時細胞多數(shù)被殺死。高溫主要引起酶的滅活、類脂質破壞，核分裂的破壞，產(chǎn)生凝固酶使細胞發(fā)生凝固，另外使蛋白質變性。因此，體外培養(yǎng)細胞時一定要避免高溫。
二、滲透壓
細胞在高滲溶液或低滲溶液中，可以立即發(fā)生皺縮或腫脹、破裂。所以，滲透壓是體外培養(yǎng)細胞的重要條件之一。哺乳動物和其他動物組織細胞體外培養(yǎng)的滲透壓的維持主要與NaCl有關，但不能忽視其他電介質滲透壓的關系。滲透壓與單位體積溶媒內(nèi)溶質的分子數(shù)和離子數(shù)成正比。為此，按一定比例控制培養(yǎng)液中離子平衡，維持正常滲透壓是很重要的。這不僅是為了維持細胞張力，而且是為了調節(jié)細胞的代謝。因為細胞外離子輸送和離子濃度改變著其他營養(yǎng)物質的輸送（如氨基酸、蔗糖等），直接影響細胞基本合成系統(tǒng)。
理想的滲透壓因細胞的類型及種族而異，人血漿滲透壓為290mmol/L，被視為是體外培養(yǎng)人類細胞的理想滲透壓。哺乳類動物細胞的滲透壓一般為290～300mmol/L。人胚肺成纖維細胞為250～325mmol/L，鼠則為310mmol/L左右。在實際應用中，260～320mmol/L的滲透壓可適于大多數(shù)細胞。
三、氣體環(huán)境和pH
體外培養(yǎng)細胞需要理想的氣體環(huán)境，氧和二氧化碳是細胞生存必須的條件之一。氧參加細胞的三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量以供給細胞生長、增殖和合成各種所需成分。有些細胞在低氧條件下，可借糖酵解取得能量，但多數(shù)細胞低氧時不能生存。氧張力通常維持在略低于大氣狀態(tài)，若氧分壓超過大氣中氧的含量可能對有些細胞有害。采用開放式培養(yǎng)時（碟皿或培養(yǎng)瓶松蓋培養(yǎng)或培養(yǎng)板培養(yǎng)），一般要把細胞置于95%空氣加5%二氧化碳的混合氣體環(huán)境中。
CO2既是細胞的代謝產(chǎn)物，又是細胞生長所必需的成分，并與維持培養(yǎng)液的pH有關。在密閉瓶中CO2濃度偏低的情況下，細胞容易生長；一般不能低于1%，否則有損細胞。CO2增加將使pH下降。大多數(shù)細胞適于在pH7.2~ pH 7.4條件下生長，低于pH6.8或高于pH7.6對細胞有害，甚至退變或死亡。各種細胞對pH的要求不盡相同。一般原代培養(yǎng)細胞對pH的變動耐受性差，永生性細胞系和惡性細胞對pH的變動耐力強。但總的來說，細胞對堿性不如對酸性的變化耐受，偏酸的條件比偏堿的環(huán)境對細胞生長有利。細胞在生長過程中隨細胞數(shù)量的增多和代謝活動的加強，不斷釋放CO2，使培養(yǎng)基變酸，pH發(fā)生變化。所以，為了維持培養(yǎng)環(huán)境恒定的pH，多采用在培養(yǎng)液中加入磷酸鹽等緩沖劑的方法。磷酸緩沖劑中的NaHCO3可供給CO2，但CO2易于逸出，故只適用于封閉式培養(yǎng)。若開放式培養(yǎng)還是置于含有5%CO2的氣體環(huán)境中為宜。為克服NaHCO3調整的麻煩，也可用羥乙基哌嗪乙硫磺酸（N-2-hydroxyethyl piperazine-N'-ethanesulfonic acid, Hepes），它對細胞無毒性，也不起緩沖作用，主要作用是防止pH迅速變動，在開瓶通氣培養(yǎng)或活細胞觀察時能維持較恒定的pH。
四、無毒和無菌
無毒和無菌是體外培養(yǎng)細胞的首要環(huán)境條件。細胞在活體內(nèi)，偶爾有細菌或有害物質入侵，因體內(nèi)有強大的解毒系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，可將其解毒或清除，而不易受損害。但在離體的環(huán)境中，失去了防御系統(tǒng)，一旦有害物質入侵或細菌污染，可導致細胞死亡，前功盡棄。如培養(yǎng)瓶皿、支持物、培養(yǎng)基、瓶蓋、瓶塞上若有細胞毒性，在培養(yǎng)過程中可導致細胞死亡。因此，在選用這些器皿、材料時要注意，若這些物品消毒不*，帶菌或操作過程不小心使細胞污染，也會導致細胞死亡。若出現(xiàn)交叉污染，可使實驗室原來的細胞系失去原有特性，應引起足夠的重視（后面有詳述）。
五、輻射線和超聲波
（一）可見光
可見光的波長是3900~7800Å?？梢姽獾母鞣N有色光能引起細胞退變，延長核分裂的間期，還可顯著降低細胞的附壁能力。因此，體外培養(yǎng)細胞應避免日光直接照射，在黑暗中進行培養(yǎng)或短期存放。
（二）紫外線
弱紫外線下耐受能力強的細胞變化不大，但對敏感的細胞有損害。紫外線強時，新分離的細胞顯示：不能進行*的有絲分裂；在有絲分裂時增加了脫水收縮；在有絲分裂時細胞質的起泡減少。Elrlich腹水癌細胞經(jīng)紫外線照射后，用飛點紫外線顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)被照射表面形成水泡，隨后細胞膨脹，損害也漸變嚴重。
（三）放射線
X射線對細胞有明顯損傷。β射線可影響細胞核的分裂。γ射線使核分裂數(shù)減少并出現(xiàn)不正常的核分裂，可使細胞死亡。
（四）超聲波和振動
在超聲波振動下，細胞很快會破裂，開始是胞質發(fā)生紊亂的流動，原生質膠體結核也有明顯變化，若停止超聲波振動可回復。細胞致死的原因是由于產(chǎn)生空化作用所致。當超聲波在2.5W/cm2時，細胞受損，染色體發(fā)生畸變，首先發(fā)生畸變的是核染色體。
六、細胞接種濃度（密度）
在體外培養(yǎng)細胞中，細胞接種數(shù)對細胞的生長有影響，適宜的接種密度，可以促使細胞增殖，接種密度太低或太高都不利于細胞的生長增殖。如果培養(yǎng)液與細胞的容積比例大于2000:1，生長物質彌散到細胞外的比例將是細胞內(nèi)達到低于zui小限度的濃度，此時細胞不能再增殖，培養(yǎng)液中的pH變堿，抑制細胞生長，細胞變圓不能貼壁，甚至引起細胞死亡等。如果接種密度太高，每個細胞周圍培養(yǎng)液的容積降至0.007mm3以下，由于彌散率的降低，細胞內(nèi)生物質的濃度增加，容易使排除物或其他代謝產(chǎn)物達到飽和，能量來源也很快耗盡，因此也會妨礙細胞的增殖。
如何選擇適宜的接種濃度要根據(jù)細胞的代謝和生長繁殖速度以及工作的需要而確定。一般來說，細胞代謝旺盛、生長速度快的細胞如腫瘤細胞，接種濃度宜偏低；而正常組織細胞生長較慢，代謝不夠旺盛，接種濃度可偏高；如果是為了保種或不需急用，接種濃度可偏低些；有時為了便于觀察細胞形態(tài)結構，接種濃度也可適當降低。
七、容器轉動速度和懸浮攪動速度
有時為了研究的需要而將培養(yǎng)細胞在容器中進行旋轉或攪動，如貼壁細胞在旋轉管中培養(yǎng)，使轉鼓的轉速提高，細胞增殖率隨之提高。其原因可能是轉動使足夠的營養(yǎng)流動和較充分的氧化作用之故。
當懸浮攪拌培養(yǎng)細胞時，攪拌速度既不能太快，也不能太慢。如太慢，細胞易結團、下沉和貼壁，不利于細胞在懸浮狀態(tài)下增殖。如果太快，容易起泡沫，細胞易窒息致死，同時，強烈地攪動易使細胞因機械損傷而破裂。所以選擇適宜的攪拌速度很重要。如BHK21的攪拌速度適宜為460~330r/min；淋巴細胞（Raji）株，在200 r/min 和400 r/min 時細胞數(shù)不增不減，或稍有下降，而攪拌速度增加到600 r/min時出現(xiàn)生長；類淋巴細胞（Namalva）生長速度快，在80~100 r/min 時既不結團，又不需加抗泡沫劑，且細胞生長仍然很快。各種細胞的適宜攪拌速度不一致，通常與細胞的特性和質量有關，予以注意。
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