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分析ELISA試驗(yàn)非正常檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生的常見(jiàn)原因
更新時(shí)間:2017-02-23   點(diǎn)擊次數(shù):1426次

一、顯色淡,靈敏度偏低

1、elisa試劑盒白介素類(lèi)在運(yùn)輸途中時(shí)間太長(zhǎng),溫度太高;所以盡量縮短運(yùn)輸時(shí)間,夏季應(yīng)放冰塊降溫

2、試劑盒未充分平衡;所以試劑盒從2~8℃冰箱取出后打開(kāi)盒蓋,于室溫平衡至少20分鐘,確保所有試劑已平衡至室溫(約25℃)。

3、培養(yǎng)箱溫度不足37℃,應(yīng)注意培養(yǎng)箱溫度,放入反應(yīng)板后盡量減少開(kāi)啟次數(shù)以免影響溫度恒定,非隔水式培養(yǎng)箱尤其應(yīng)注意。

4、保溫時(shí)間不足;所以做實(shí)驗(yàn)時(shí)一定注意時(shí)間的重要性,如果怕忘了時(shí)間,可以校正定時(shí)鐘準(zhǔn)確定時(shí)。

5、洗滌時(shí)沖擊力太大、浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、洗滌次數(shù)增加;按說(shuō)明書(shū)要求保留洗滌時(shí)間,準(zhǔn)確記住洗滌次數(shù)

6、移液器吸液量不足,吸嘴內(nèi)壁掛水太多或內(nèi)壁不清潔;所以保證校正移液器,吸嘴要配套,裝吸嘴時(shí)要緊密,吸嘴內(nèi)壁要清潔,一次性使用。

7、蒸餾水水質(zhì)有問(wèn)題,要使用新鮮合格的蒸餾水。

二、重復(fù)性較差,經(jīng)常有客戶反饋說(shuō)做了兩個(gè)復(fù)孔值相差太大。可能的問(wèn)題有:

 1、樣品數(shù)量多少不一,加樣時(shí)間有長(zhǎng)有短;所以重復(fù)某一樣品時(shí),加樣時(shí)間盡可能與*次接近。

 2、保溫時(shí)間不一致,洗滌條件不一致,操作人員不一致;重復(fù)測(cè)定標(biāo)本,操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致,以排除這些因素造成的不一致的可能性。

 3、加樣量不一致;樣品稀釋前應(yīng)充分混勻,盡可能使用同一移液器并裝緊吸嘴。

三、假陽(yáng)性結(jié)果和假陰性結(jié)果

1、標(biāo)本的采集與保存

1.1當(dāng)標(biāo)本采集保存不當(dāng)產(chǎn)生溶血時(shí),紅細(xì)胞中的血紅蛋白釋放到血清中,血紅蛋白具有過(guò)氧化物酶的性質(zhì),其通過(guò)吸附或“PP效應(yīng)”(蛋白質(zhì)間相互吸附的現(xiàn)象)結(jié)合后,可催化A、B液顯色而造成假陽(yáng)性

1.2標(biāo)本采集保存不當(dāng)致細(xì)菌污染,菌體中可能含有內(nèi)源性HRP,會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng);elisa試劑盒白介素類(lèi)標(biāo)本在冰箱中保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致血清IgG聚合,易使間接法的試驗(yàn)本底加深。因此,標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè)。

1.3反復(fù)凍融血清會(huì)使抗體效價(jià)跌落,所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如需保存做多次檢測(cè),宜少量分裝凍存。

2、加樣

2.1如果 樣品稀釋液少加或血清多加,都會(huì)引起本底增高。對(duì)于間接法來(lái)說(shuō),受上述兩個(gè)因素影響更大。因?yàn)檠逯惺軝z的特異性IgG只占IgG的一小部分。IgG的吸附性很強(qiáng),非特異性IgG可直接吸附到固相載體上,有時(shí)也可吸附到包被抗原的表面。這些非特異性的IgG均可以和酶標(biāo)二抗發(fā)生反應(yīng)而造成較高陰性本底或假陽(yáng)性。如果加入的血清過(guò)多,高于規(guī)定的稀釋倍數(shù),極易造成高值陰性。反之,造成假陰性。

2.2  如果加入的酶結(jié)合物過(guò)多或加在較高的孔壁上或孔口,也會(huì)引起本底升高或假陽(yáng)性。

2.3如果血液未開(kāi)始凝固或凝固不*時(shí)就強(qiáng)行離心分離血清,此時(shí)的血清中仍留部分纖維蛋白原,在ELISA測(cè)定過(guò)程中可以形成肉眼可見(jiàn)的纖維蛋白塊,易造成假陽(yáng)性結(jié)果。

3.  溫育

3.1  由于ELISA試驗(yàn)在一定溫度下的反應(yīng)時(shí)間并不是反應(yīng)的終點(diǎn),溫育時(shí)間過(guò)短、溫度過(guò)低,易致顯色不全;溫育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、溫度過(guò)高,易致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周?chē)?,難以清洗*,產(chǎn)生陰性高值或假陽(yáng)性反應(yīng)。因此,要嚴(yán)格按規(guī)定的溫度和溫育時(shí)間進(jìn)行。

3.2  由于水浴較難將溫度控制在穩(wěn)定的范圍,因此我們每次試驗(yàn)時(shí)應(yīng)認(rèn)真觀察水浴箱的溫度,盡量少開(kāi)啟水浴箱門(mén),嚴(yán)格控制水浴的溫度為37±0.5。同時(shí),微孔板不可重疊放置,以保證傳熱均勻,各板的溫度都能迅速達(dá)到平衡。

3.3  由于試劑盒通常設(shè)定的反應(yīng)溫度為37度,在這個(gè)溫度下溫育一定時(shí)間,蒸發(fā)的水分會(huì)很多,對(duì)于整個(gè)反應(yīng)體系來(lái)講,各種反應(yīng)物的濃度會(huì)不斷地增加,這樣必會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)zui后的值升高。因此溫育時(shí)應(yīng)貼上封板膠。

4.  洗板

洗板在ELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟,但卻是決定試驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。ELISA就是靠洗板來(lái)達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的,通過(guò)洗板以清除殘留在板孔中沒(méi)能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的,而在洗板時(shí)應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。在ELISA操作中,洗滌是zui主要的關(guān)鍵技術(shù),應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌。洗板如不*,有酶結(jié)合物的非特異性吸附,將使空白值升高。另外,在間接法中如血清標(biāo)本內(nèi)的非特異性IgG吸附在固相上而未被洗凈,也將與酶標(biāo)記抗體作用而產(chǎn)生干擾。

4.1  各的洗液是根據(jù)各自試劑的條件配制的,因此采用不配套的洗液常會(huì)得到不正常的反應(yīng)結(jié)果,包括本底升高,所以不同的洗液不應(yīng)混用。

4.2  洗液應(yīng)按規(guī)定的倍數(shù)稀釋使用。試劑盒提供的洗液是濃縮的,過(guò)多稀釋洗液,會(huì)影響洗液的效果,而使反應(yīng)的本底升高。反之造成假陰性。

4.3  elisa試劑盒白介素類(lèi)稀釋洗液的水應(yīng)該是新鮮的蒸餾水,電導(dǎo)率小于1.5us/cm。如果水中含有過(guò)多的鈣、鎂離子,這些離子會(huì)占用表面活性劑,使試驗(yàn)本底增高。

 

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